Diagnóstico (Sara Cordero y Miguel López)

Antes de 1950, la FQ era una entidad conocida pero no bien catalogada, que se englobó en determinados momentos como uno más de los diferentes síndromes malabsortivos o, incluso, como un déficit primario de vitamina A. Probablemente, la inexistencia de pruebas diagnósticas fiables dificultó la comprensión de la enfermedad. El desarrollo del test del sudor en 1959 significó el principal avance en el diagnóstico y, a pesar de los cuarenta años transcurridos, esta prueba sigue constituyendo el pilar fundamental.

TEST DEL SUDOR O PRUEBA DE ELECTROLITOS EN EL SUDOR:

 Con esta prueba se mide la concentración de cloruro sódico en el sudor, tras estimular la glándula sudorípara por iontoforesis con pilocarpina. Se considera positivo si se encuentra una concentración de cloro superior a 60 mmol/l en dos muestras separadas. En los niños, una concentración superior a 40 mmol/l es muy sugestiva de FQ. 

Ha de tenerse en cuenta que la concentración de iones aumenta discretamente con la edad, y que algunos sujetos sanos pueden tener valores superiores a 60 mmol/l. 

En caso de duda se puede realizar la determinación de la concentración de sodio y determinar el cociente Cl/Na, que es mayor de 1 en los pacientes con FQ, estando ambos iones proporcionalmente elevados. 

El test puede tener falsos positivos en el hipotiroidismo, la insuficiencia suprarrenal, la malnutrición grave o la anorexia nerviosa, entre otras. 

En aquellos casos en los que el test del sudor no es concluyente, se ha demostrado como una herramienta muy útil la constatación de la alteración del transporte activo de iones (sodio y cloro) que se produce en el epitelio respiratorio, a través de la medida del diferencial del potencial transnasal (PDN):

El epitelio ciliado respiratorio (incluido el epitelio nasal) regula la composición de fluidos de la superficie de las vías respiratorias mediante el transporte activo de iones sodio y cloro. Este transporte iónico genera una diferencia de potencial transepitelial que puede medirse in vivo, se expresa en milivoltios (mV), depende de la concentración de los diferentes iones y es negativa respecto a la submucosa. La submucosa de todos los epitelios respiratorios es isoeléctrica, al igual que el tejido celular subcutáneo. Por eso es posible tomar como valor de referencia (para establecer una diferencia de potencial transepitelial) cualquier tejido subcutáneo en zonas del cuerpo humano de fácil acceso.
Otro método de diagnóstico de cierta utilidad es la llamada prueba del tripsinógeno inmunorreactivo, que consiste en la extracción de una muestra de sangre que posteriormente es examinada en busca de un aumento en los niveles de tripsinógeno inmunorreactivo, una proteína producida por el páncreas que está relacionada con la fibrosis quística.

Por otra parte, desde 1975 se han descrito pacientes con alta sospecha diagnóstica de FQ, pero con un test del sudor negativo. Estos casos han ido proliferando paralelamente al mayor conocimiento del gen de la CFTR y de los efectos que sus mutaciones tienen sobre el individuo.

El único método directo existente para el diagnóstico de la enfermedad es el hallazgo de mutaciones en los dos alelos del gen de la CFTR. Hasta la fecha se han descrito más de 1824 mutaciones, lo que dificulta en gran medida el diagnóstico molecular.  

El amplio abanico de mutaciones existentes ha permitido establecer importantes relaciones entre el genotipo del paciente (la combinación de mutaciones que presenta) y los fenotipos (características clínicas de la enfermedad). El fenotipo clásico de la FQ, con insuficiencia pancreática, infertilidad masculina, enfermedad pulmonar progresiva y concentración elevada de iones en el sudor, se asocia a la presencia de mutaciones graves (siendo la  F508 la mutación tipo) en ambos cromosomas. Este tipo de enfermo es el que suele diagnosticarse en la etapa infantil. El problema diagnóstico puede surgir cuando se encuentra un paciente con, al menos, una mutación leve. En estos casos, el espectro clínico de la enfermedad puede variar ampliamente, con ausencia de clínica digestiva, fertilidad e, incluso, un test del sudor normal, con el consiguiente problema diagnóstico que conlleva.

Para aumentar la eficacia y precisión en el diagnóstico de esta enfermedad, se han desarrollado una serie de pruebas que podrían englobarse con el nombre de diagnóstico molecular. Este diagnóstico puede ser directo o indirecto.

- Diagnóstico molecular indirecto: basado en el análisis del ligamiento, es decir, de la segregación conjunta de la enfermedad y secuencias polimórficas ligadas al locus de la misma. Existen varios métodos:

• RFLP (Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción): es una técnica actualmente en desuso. Los RFLP son marcadores génicos del ADN que se pueden encontrar en exones, intrones o en el ADN que separa un gen del otro. La técnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas. Se analizaba el ADN de los miembros de una familia afectada por la enfermedad, y se buscaban los alelos para RFLP que mostraban patrones de herencia similares a los de la enfermedad. Una vez el gen era localizado, el análisis RFLP de otras familias podría predecir su riesgo de padecer esa enfermedad, o quiénes tenían posibilidades de portar el gen mutante.
• Marcadores microsatélites: es el método utilizado en la actualidad, con el inconveniente  de que los estudios solo son válidos dentro del mismo árbol familiar. Los microsatélites son secuencias de ADN en las que un fragmento se repite de manera consecutiva. La variación en el número de repeticiones crea diferentes alelos. Los microsatélites del gen CFTR se ubican en las regiones intrónicas.  La estandarización y el análisis de estos microsatélites en una población de individuos afectados puede resultar muy útil para el estudio de las mutaciones causantes de la enfermedad.
• Marcadores SNP: los estudios del polimorfismo de un único nucleótido serán los más empleados en un futuro próximo, debido a la ventaja de que los resultados obtenidos son aplicables entre personas no emparentadas.

- Diagnóstico molecular directo: basado en la detección de las mutaciones, que se realiza básicamente a partir de dos estrategias:

• Rastreo de mutaciones: mediante estas técnicas, se detecta si hay mutación, pero no es posible identificarla. La técnica más empleada es la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacion (DGGE), que consiste en la separación de cadenas de ADN de doble cadena dependiendo de su punto de desnaturalización. Es una técnica que permite discernir diferencias o composiciones discretas entre muestras de moléculas de complejidad variable, y que de otras formas analíticas, serían muy costosas de diferenciar. Así, permiten detectar si existe alguna mutación en el genoma, pero no identificar exactamente de que mutación se trata. Al ser posible discriminar dos cadenas dobles de ADN con el mismo tamaño pero con diferencias en secuencia si la energía necesaria para llegar a su desnaturalización es diferente, DGGE permite definir aproximadamente la cantidad de fragmentos de ADN del mismo tamaño que tienen secuencias con diferente contenido de GC.
• Identificación de mutaciones, que son técnicas basadas en hibridación específica con el alelo mutado. Cabe destacar dos técnicas:

       - ASO dot blot :Este método consiste en amplificar el ADN de interés y fijarlo directamente a la membrana de trabajo (por ejemplo con irradiación UV), para luego añadir oligonucleótidos de unas 20 pb específicos del alelo que quiere detectarse. Estos oligos son marcados previamente con radiactividad, fluoróforos o cualquier otro tipo de marcaje. Tras la hibridación, se obtienen los resultados detectando el marcaje utilizado.

    Para la detección de mutaciones se fija una fila de muestras, cada una correspondiente a un individuo diferente, del cual se ha amplificado la región de ADN que puede o no contener la mutación. Primeramente se hibridan las muestras con un oligo específico de uno de los alelos (el silvestre o normal, por ejemplo) y se revela el resultado. A continuación, se lava la sonda y se añade una nueva, específica del otro alelo (el alelo mutado, por ejemplo). Aquellos individuos que dieran positivo para las dos hibridaciones serían heterocigotos para la mutación (poseen un alelo normal y el otro mutado), mientras que aquellos que solamente presentasen hibridación en uno de los casos serían homocigotos para ese caso (para el alelo silvestre o el mutado).

          - OLA: también llamado ensayo de ligación de oligonucleótidos, es una técnica de diagnóstico que automatiza la técnica dot blot. Se empieza con una PCR para amplificar los fragmentos de ADN del gen de estudio. A continuación se realizan ciclos de ligamiento con ligasa termoestable y oligos específicos de los alelos. Luego se estudian los fragmentos por medio de una electroforesis capilar.El juego con las longitudes y los colores de los fluorocromos nos permite distinguir las distintas mutaciones y los distintos alelos de cada uno.



Finalmente, cabe mencionar que el screening neonatal de la FQ, aunque conocido desde 1971, sólo se realizaba en 1997 en tres estados de los EE.UU. y en Autralia. 
Consiste en determinar en sangre periférica (3 a 5 días después del nacimiento) la tripsina inmunorreactiva y, si ésta se encuentra elevada, efectuar un estudio genético para la mutación  F508. Si dicha mutación está en homocigosis, el recién nacido padece una FQ. Si sólo se detecta una mutación podría tratarse de un portador. Este protocolo tiene una sensibilidad de un 95%, buena especificidad y un valor predictivo positivo del 15-35%33. Algunos autores defienden esta estrategia dado que la evolución de los pacientes diagnosticados por screening es mejor desde el punto de vista nutricional, aunque apenas se modifica en lo referente a la función pulmonar. Otros autores la rebaten, pues se ha comprobado que los pacientes diagnosticados por screening neonatal se colonizan más precozmente por P. aeruginosa, probablemente debido a las frecuentes visitas hospitalarias.