Besos salados (Loreto Rojas)

“Pobre niño aquel que al besar su frente sabe a sal, un misterioso embrujo pesa sobre él y no tardará en morir” Anónimo siglo VII  

   Otro resfriado, se lamenta la madre de un niño de un par de meses de vida al oír de nuevo su tos. Al acudir a calmarle y a besarle, reconoce un sabor desgarrador en la piel de su octavo hijo. Este sabor salado le hace evocar el amargo recuerdo de su primer hijo, que pasó a otra vida a los pocos meses de nacer, siempre inundado por este aroma a sal. La madre no cabía en su angustia, se temía lo peor. El mal había recaído sobre su familia, ninguna otra a su alrededor padecía tal embrujo.

   Hasta principios del siglo veinte, muchas familias como la del ejemplo, atribuían la muerte de sus hijos a un maleficio. Pero, no caía en esta asociación únicamente la gente con pocos conocimientos sobre medicina; profesores como Pauw y Alonso, ya en el siglo XVII, seguían considerando a los pacientes con estos síntomas embrujados. No fue hasta 1905 cuando se empezó a atribuir el conjunto de los síntomas que se presentaban en estas familias a causas biológicas, Landsteiner postuló que el íleo meconial, del que se hablará más adelante, y la fibrosis del páncreas se debían al fallo de una enzima.También se decribieron casos en los que los niños morían de bronconeumonía y se asoció con la enfermedad celiaca. Pero, fue con Andersen con quien el maleficio tomó nombre de enfermedad, la fibrosis quística. Más adelante se empezó a considerar la enfermedad como sistémica

   Pero, nos queda saber porque se suelen dar varios casos en los hijos de una misma pareja. La respuesta a esto la dieron Lowe y sus colaboradores, señalando que la causa de esta enfermedad podría ser la mutación de un gen, con un patrón de herencia autosómico recesivo. Esto explicaría por que, en el ejemplo antes expuesto, dos de los ocho hijos tienen la enfermedad, ya que la probabilidad de tener un hijo enfermo con este patrón de herencia es de 1/4. Con esto, se empieza a ver que la explicación transcendental que pudiera darse a este mal familiar. tiene una base probabilística, la genética.



   En los ochenta, se relacionó la enfermedad con el defecto en el transporte de electrolitos en la membrana. Al final de ese año, se identifica el gen de la fibrosis quística, en el cromosoma 7, así como la proteína que codifica, el CFTR, de la que hablaremos en la próxima entrada. Desde entonces, se han identificado múltiples mutaciones de este gen, la primera descubierta y la más frecuente, ΔF508, fue descubierta por Lap-Chee Tsui y su equipo. Se trata del primer trastorno genético dilucidado por la técnica de la genética inversa, que consiste en producir mutaciones en una secuencia de ADN conocida para estudiar sus efectos. Para identificar y secuenciar este gen sirvieron las técnicas de paseo y salto cromosómicos. Algunos de los investigadores de la genética de esta enfermedad, como Collins, participarían a continuación en el Proyecto Genoma Humano. 

    Todos estos descubrimientos en la genética, y los que están por suceder, permiten conocer mejor como va a evolucionar un paciente con esta enfermedad, ya que conociendo las mutaciones que tiene, se puede deducir la gravedad de la fibrosis quística. También nos ayudan a encontar un tratamiento eficaz, ya que la clonación del gen de la fibrosis quística abre las puertas a la terapia génica como tratamiento de la misma. 

La importancia del CFTR en la fibrosis quística (Loreto Rojas)

   La fibrosis quística es una enfermedad cuya causa principal es una mutación en el gen que codifica la proteína CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). 

Estructura

  El CFTR es una proteína transmembrana de paso múltiple que pertenece a la familia de los transportadores ABC (ATP binding cassetes), que son los encargados del transporte activo de sustratos a través de la membrana, utilizando el ATP como fuente de energía. Como podemos ver en la imagen, esta molécula consta de dos regiones idénticas, cada una de las cuales compuesta por un dominio transmembrana (MSD), formado por seis hélices, unidas a un dominio NBF hidrofílico que se encuentra en el interior celular. Este dominio es el de unión del ATP. Estas dos regiones se unen entre sí mediante el dominio R, que contiene abundantes residuos cargados, sustrato de la fosforilación por la proteinquinasa A (PKA) o PKC, que permite la regulación del transportador.

Función

   La utilidad principal del CFTR es la de transportador de cloruro (Cl-) en células de secreción exocrina, como las glándulas salivales, el páncreas, el intestino... Realiza un transporte activo de cloro hacia el exterior celular. Pero, esta no es la única función de esta proteína. Fiel a su nombre, es "regulador de la conductancia transmembrana", ya que no solo transporta Cl-, si no que regula el transporte de distintos iones, como el Na+ y el K+ y otros de Cl-. También juega un papel importante en el transporte de ATP y regulación del pH.




Fisiopatología

    La fibrosis quística se produce cuando ocurre alguna mutación en el gen CFTR disminuyendo el número o haciendo desaparecer las proteínas CFTR de la membrana de las células secretoras. Esto impide el transporte de Cl- al exterior celular, provocando su acumulación en el interior de la célula. Pero, esta mutación, no solo afecta a las concentraciones de Cl-. El cambio en la concentración de cloro, aumenta el gradiente de Na+, provocando que el transportador ENaC introduzca mayor cantidad de Na+ en el interior celular. El resultado de esto es un medio extracelular pobre en iones, lo que provoca la entrada de agua al interior celular por ósmosis. En el medio extracelular, en torno a los cilios de estas células, de forma fisiológica hay un líquido, formado por agua y moco, que protege de las infecciones bacterianas, y mantiene los niveles de hidratación adecuados. Si se reduce el agua en este fluido, se vuelve más viscoso. Esto tiene distintos efectos nocivos en los órganos en los que se produce, en las vías respiratorias produce la retención de microorganismos, facilitando las infecciones recurrentes, además de obstruir las vías. En el páncreas, obstruye las vías de secreción, produciendo defectos en la digestión. Se profundizará más en esto cuando se hable de los síntomas. A continuación, os dejamos un video explicativo del mecanismo del que estamos hablando, en el páncreas, en concreto.

Por último, adjuntamos un video muy ilustrativo que habla de todo lo contado en esta entrada, por si no ha quedado algún concepto claro, además de introducir temas que se tratarán en entradas posteriores.

Gen CFTR y mutaciones: (por David Serantes)

1. Gen CFTR:

El gen CFTR responsable de la FQ fue identificado mediante técnicas de clonación en 1989. Se localiza en el brazo largo del cromosoma 7 en el sector denominado q31- q3219, 20. Codifica un transportador ABC (ATP-binding cassette) de gran tamaño (170 kD), CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), que está ubicado en la zona apical de la membrana de las células epiteliales y que funciona como un canal selectivo de cloro y regula otros canales iónicos. Se expresa en las células secretoras, en senos paranasales, pulmones, páncreas, hígado y tracto reproductivo.  

Este gen mide aproximadamente 250 kilobases, tiene 27 exones y transcribe un ARN mensajero de 6.500 bases.

2. Mutaciones más típicas:

Desde el descubrimiento y clonaje del gen CFTR se han descrito más de 1200 mutaciones, de las que únicamente 4 (excluyendo la DF508) se encuentran en más de 2% de los casos. La frecuencia de algunas de estas mutaciones varía entre los distintos grupos geográficos (por ejemplo, la W1282X constituye el 48% de los alelos FQ de los judíos Ashkenazi, pero sólo el 2% de total de alelos FQ, y el 87,5% de enfermos con la mutación Q359K/T360K son de etnia judía-georgiana).

La mayor parte de los defectos moleculares del gen CFTR son mutaciones puntuales de una única base o bien deleciones o duplicaciones de un pequeño número de nucleótidos en el gen CFTR. De estas, 42% son con cambio de sentido, 24% son pequeñas inserciones o deleciones con cambio en el marco de lectura, 16% son mutaciones sin sentido, 16% afectan a regiones de ajuste o splicing y 2% producen la pérdida de un aminoácido. También se han descrito algunas deleciones grandes.

Diagrama esquemático de la duplicación del exón 9 propuesto por retrotransposición.

Una de las particularidades de CFTR es la presencia de transcritos que muestran la deleción de uno o más exones entre los individuos normales debido a alteraciones en el proceso de splicing alternativo, de la que la más frecuente es la deleción del exón 9. La presencia o ausencia de este exón se correlaciona con la presencia de un polimorfismo de la secuencia del intrón 8 cercano al punto aceptor del splicing (5T, 7T o 9T). Si se encuentra la forma 7T o 9T se produciría un procesamiento normal en el 90% de las moléculas de ARNm; sin embargo, la presencia de la forma 5T solo garantiza el procesamiento normal de entre el 10 y 40 % de las moléculas de ARNm.

Algunas de las mutaciones comunes del gen CFTR se producen en los exones 4, 7, 8, 9 y 10.

La proteína CFTR actúa como un canal permeable a cloro de la membrana extracelular. Se muestra el lugar común de la deleción de los tres pares de nucleótidos entre los alelos mutantes de CF.

Sin lugar a dudas, la mutación más frecuente es la deleción del codón que produce la pérdida de un residuo de fenilalanina en la posición 508, que afecta la síntesis del primer dominio de unión a nucleótido (NBD1), lo que resulta en un defecto en el plegamiento, y con ello en una destrucción prematura de la proteína. Es denominada mutación DF508 (ΔF508) y se ha clasificado dentro de las mutaciones de tipo II, en base a estudios que demostraron que la proteína CFTR mutada era sintetizada pero no maduraba de manera adecuada.  Cerca del 70% de pacientes con FQ exhiben esta deleción de tres pares de bases del exón 10 del gen CFTR, aunque existen grandes variaciones geográficas que oscilan entre 32 y 82%. , Por ejemplo, en Dinamarca hay un 88% de casos con la mutación DF508, mientras que en Italia solo representan el 50%. Generalmente, los homocigotos para DF508 expresan enfermedad pulmonar, insuficiencia pancreática, azoospermia obstructiva y universalmente tienen test de sudor elevado. Sin embargo, la función pulmonar es variable, lo cual sugiere la presencia de otros factores genéticos y ambientales.

Como explicación a la amplia extensión de esta mutación en la población europea se ha sugerido la posible existencia de una ventaja selectiva de los individuos heterocigotos portadores de ella. Según esta hipótesis, los heterocigotos estarían más protegidos frente a la deshidratación provocada por las diarreas causadas por las enterotoxinas bacterianas. La proteína DF508, junto a una menor expresión de CFTR en las superficies epiteliales, disminuirían la entrada de patógenos en el epitelio intestinal, protegiendo frente a estas infecciones.

3. Clasificación de las mutaciones:

En la actualidad se han descrito seis clases de mutaciones. Las mutaciones de las clases I-III son las más comunes y están asociadas usualmente con insuficiencia pancreática. Esta característica está en relación con el efecto de la mutación en la producción de la proteína CFTR.

Clase 1: mutaciones que alteran la producción de la proteína. 

Se deben a un defecto de inestabilidad del ARNmensajero o de una proteína anormal, la cual es rápidamente degradada. Estas mutaciones tienen como consecuencia la ausencia total o parcial de la proteína. En esta clase se incluyen las mutaciones que conducen a la formación prematura de un codón de parada de la traducción (algunas de las cuales producen alteraciones del splicing mientras que otras producen un cambio en el marco de lectura). 

En algunos casos la no producción de la proteína se debe a que el ARNm formado es inestable. En otros casos, aunque se produce la proteína, esta es inestable y es degradada rápidamente. 

Funcionalmente todas estas mutaciones se caracterizan por una pérdida de la conductancia del canal de Cl- en el epitelio afectado. Ejemplo de estas mutaciones es G542X, que consiste en el cambio puntual de una guanina por una timina en la posición 542 del aminoácido glicina del exón 11 del gen, lo cual lleva a la formación de un codón de parada. Esta mutación es la más frecuente en España tras la ΔF508.

Clase 2: mutaciones que alteran el proceso de maduración celular de la proteína. 

Ciertas mutaciones alteran la maduración de la proteína y su transporte a la membrana plasmática, de manera que este transportador no está presente en la membrana o lo está en muy baja cantidad. El resultado es un producto proteínico defectuoso que se destruye en el proteasoma.

Estas variaciones son las más frecuentes ya que incluyen la mutación DF508, que, como ya se ha comentado, representa en torno al 70% del total.

Clase 3: mutaciones que alteran la regulación del canal de Cl-. 

Se encuentran frecuentemente en el dominio de unión al ATP (NBF1 y 2). Un ejemplo es G511D, producida por un cambio entre la glicina y el ácido aspártico en la posición del codón 511 del exón 11 el gen CFTR. Esta mutación, la tercera más común a nivel mundial con una frecuencia cercana al 3%, se localiza en el primer dominio NBD, por lo que interfiere en la hidrólisis de ATP. La proteína se sintetiza, procesa, transporta e inserta en la membrana apical correctamente, pero presenta una fuerte reducción de la actividad de este canal. 

Clase 4: mutaciones que alteran la conducción a través del canal de Cl-. Ciertos segmentos de los dominios que atraviesan la membrana participan en la formación de un poro de iones. Las mutaciones con cambio de sentido situadas en estas regiones generan una proteína correctamente posicionada con actividad de canal de Cl- AMPc dependiente. Sin embargo, sus características son distintas a las del canal CFTR nativo, ya que muestran una disminución del flujo de iones y una selectividad modificada. Como ejemplo podemos resaltar R117H.

Clase 5: mutaciones que alteran la estabilidad del RNAm. 

Suelen ser mutaciones del activador o del emplame intrón-exón que reducen el número de transcriptos de ARNm, permitiendo algunos productos proteínicos normales. Un ejemplo es A455E.

Clase 6: mutaciones que alteran la estabilidad de la proteína madura.

Conllevan un aumento de las tasas de recambio de los canales cloruros en la superficie celular.

4. Heterogeneidad alélica:

Como acabamos de ver, la Fibrosis Quística es un trastorno genético que puede deberse a diferentes mutaciones. Es decir, existe más de una causa para lo que se ha concebido como una única enfermedad. Dado que diferentes alelos mutados de un mismo locus producen una expresión fenotípica variable, hablamos de heterogeneidad alélica.

La heterogeneidad alélica es una causa importante de la variación clínica. En ocasiones, las diferentes mutaciones dan lugar a trastornos clínicamente indistinguibles, pero en otros casos, los alelos mutantes diferentes generan un fenotipo similar, pero con un espectro de gravedad. Por ejemplo, algunas mutaciones del CFTR pueden hacer que los pacientes sufran la forma clásica de fibrosis quística, caracterizada por la insuficiencia pancreática, enfermedad pulmonar grave y progresiva y ausencia congénita de los conductos deferentes en hombres, mientras que los pacientes portadores de otros alelos mutantes pueden manifestar la afectación pulmonar con una función pancreática normal, o únicamente las alteraciones correspondientes al tracto reproductor masculino.

5. Otros posibles genes involucrados:

Algunos estudios interesantes han explorado el efecto de otras mutaciones en genes y el polimorfismo en los fenotipos de FQ, tratando de explicar la variabilidad de los pacientes homocigotos para DF508. Por ejemplo, el gen de la a1-antitripsina y sus mutaciones S y Z han sido involucrados en las formas leves. En contraste, el gen de la lectina ligadora de manosa (MBL) está asociado a un peor pronóstico. MBL es parte del sistema inmune innato de todo ser humano y es particularmente importante en los primeros meses de la vida. Existe una asociación entre los sujetos portadores de alelos defectuosos con una peor función pulmonar, especialmente los pacientes con FQ con una infección crónica por P. aeruginosa. El factor de transformación de crecimiento (TGFB-1) es también un importante modificador de genes. Además, otros genes que codifican citoquinas como Il-1 o IL-10 y el factor de necrosis tumoral (TNF) están siendo estudiados, pero estas áreas de investigación están aún en desarrollo.

Enlaces de interés:
http://www.genet.sickkids.on.ca/resource/Table1.html En este enlace aparece una tabla extensa con las mutaciones más comunes del gen CFTR a nivel mundial, resaltando la frecuencia y la población con mayor prevalencia.

http://www.genet.sickkids.on.ca/CftrDomainPage.html Enlace a la base de datos general de mutaciones de la fibrosis quística. Permite visualizar, en este dominio en concreto, la estructura en detalle de la proteína CFTR.

Síntomas y signos. (Aarón Caño)

FIBROSIS QUÍSTICA: SÍNTOMAS Y SIGNOS.

Epidemiología de la Fibrosis Quística: (por David Serantes)

EPIDEMIOLOGÍA:

1. Frecuencia y esperanza de vida:

La fibrosis quística (FQ) es una de las enfermedades genéticas más frecuentes en la raza caucásica, con una incidencia en dicha población de aproximadamente 1/5000 nacidos vivos. Entre las personas de ascendencia europea, la Fibrosis Quística es el trastorno genético autosómico recesivo mortal más frecuente. Una de cada 25 personas de ascendencia europea y una de cada 29 personas de ascendencia askenazí son portadores de una mutación de fibrosis quística.

Incidencia relativa de la mutación ΔF508 en Europa.

Es, asimismo, uno de los trastornos monogénicos más habituales en América del Norte, donde 1 de cada 2000-4000 nacimientos de americanos de ascendencia europea están afectados. En USA aproximadamente 30.000 individuos padecen FQ.

En otras poblaciones su frecuencia es menor: en afroamericanos es de 1 de cada 15000 nacimientos y es inferior a 1 de cada 30000 en americanos de origen asiático. Aunque es menos común en estos grupos, aproximadamente uno de cada 46 hispanoamericanos, uno de cada 65 africanos y uno de cada 90 asiáticos son portadores de al menos un gen CFTR anormal. Argentina y Uruguay representan una excepción en el contexto de América Latina, con una incidencia de casos muy próxima a la registrada en Estados Unidos o Canadá, y una prevalencia de portadores sanos en la población general de entre 1 en 30 y 1 en 25,63, respectivamente.

Actualmente no es posible explicar la elevada frecuencia del alelo mutante CFTR (en uno de cada 50 alelos) que se observa en los grupos de población de raza blanca. El alelo ΔF508 es el único que hasta el momento ha sido detectado en la práctica totalidad de los grupos de población de raza blanca. El análisis del haplotipo en las poblaciones de raza blanca indica que el alelo ΔF508 posiblemente tiene un origen único. La frecuencia de este alelo entre todos los alelos mutantes muestra variaciones significativas en los diferentes grupos de población europeos, desde el 88% en Dinamarca hasta el 45% en el sur de Italia.

Aproximadamente el 70% de los portadores de la FQ muestra mutación ΔF508. Excepto en lo que se refiere a la mutación de este alelo, las mutaciones presentes en los pacientes con FQ en el locus CFTR son individualmente muy infrecuentes, aunque en algunas poblaciones específicas hay otros alelos que pueden ser comunes.

Esperanza de vida:

La supervivencia media a nivel mundial para estos pacientes se estima en 35 años, alcanzando valores más altos en países con sistemas sanitarios avanzados, por ejemplo en Canadá la duración media de la vida era de 48 años en 2010.

Herencia mendeliana autosómica recesiva: dos mutaciones de línea germinal (una de cada uno de los padres) para desarrollar la enfermedad; igualmente transmitida por hombres y mujeres.

2. Disomía uniparental.

La disomía uniparental es un modo atípico de herencia según el cual un progenitor aporta los dos cromosomas del par de homólogos (o bien regiones de los mismos) y el otro, ninguna. Dentro de este fenómeno inusual podemos diferenciar dos patrones:

Hablamos de isodisomía cuando el progenitor aporta dos copias de un cromosoma homólogo, es decir, los dos cromosomas homólogos son idénticos y proceden de un mismo progenitor. La isodisomía puede provocar una enfermedad autosómica recesiva en el hijo de un progenitor heterocigótico si este aporta 2 copias del cromosoma homólogo que contiene la mutación causante de enfermedad.

Por otro lado, en la heterodisomía, el progenitor aporta una copia de cada homólogo.

El 1º caso documentado de disomía uniparental se observó a finales de los 80 en una mujer con fibrosis quística cuya madre, portadora heterocigota, le había transmitido 2 copias del cromosoma 7 que contenía un gen CFTR mutado, mientras que el otro progenitor no había transmitido ninguna copia de este cromosoma.

La disomía uniparental puede producirse por la unión de un gameto con 2 copias de un cromosoma específico con un gameto que no tiene copias de ese cromosoma; o si una concepción trisómica pierde uno de los cromosomas extra y produce un embrión con 2 copias del cromosoma aportado por un progenitor.

En el embrión inicial, las células con disomía uniparental pueden tener su origen en errores mitóticos como pérdida cromosómica con duplicación posterior del cromosoma homólogo.

La fibrosis quística es un trastorno en que encontramos este patrón atípico de herencia. Otros ejemplos son la hemofilia A (en que la disomía uniparental afecta a los cromosomas sexuales) o los síndromes de Prader-Willi y Angelman. 

3.Teorías sobre la prevalencia de la FQ:

Se han formulado numerosas hipótesis intentando explicar por qué una mutación letal como esta ha persistido y se ha extendido entre la población humana. Varios estudios han planteado que los heterocigotos para la mutación DF508 pueden tener una ventaja selectiva. Algunas enfermedades autosómicas recesivas comunes como la anemia falciforme han revelado la propiedad de proteger a sus portadores de otras afecciones, como la malaria, concepto conocido como ventaja heterocigota.

Estos estudios se han basado en dos hechos de destacada importancia: en primer lugar, la alta frecuencia de portadores de gen mutado (1/25 en personas de ascendencia europea) y, en segundo lugar, en la edad de la mutación ΔF508, que ha sido estimada en unos 52.000 años de antigüedad.

Se ha descubierto que la toxina del cólera requiere que sus huéspedes tengan proteínas CFTR normales para poder funcionar apropiadamente, por lo que se ha postulado que los portadores heterocigotoas de genes CFTR mutantes obtendrían un posible beneficio de la resistencia al cólera y a otras enfermedades de deshidratación intestinal.

Existen evidencias del papel del CFTR en la internalización de bacterias Gram negativas patogénas entéricas como Salmonella typhi y oportunistas como Pseudomona aeruginosa, responsables, respectivamente, de la fiebre tifoidea y de las infecciones crónicas de la Fibrosis Quística que generan la pérdida de función pulmonar. Las Salmonellas invaden las células epiteliales del intestino delgado uniéndose al primer dominio extracelular del CFTR. La exposición de los enterocitos a la Salmonella provoca la migración de moléculas de CFTR intracelulares hacia la superficie apical, paso importante en la infección. La copia defectuosa del CFTR en los heterocigotos impide estos procesos, de ahí la resistencia a la infección. Se ha concluido, por tanto, que la presencia de proteínas CFTR normales podría ser condición necesaria para el ingreso de Salmonella typhi en las células, lo que sugiere que los portadores de un alelo mutante del gen CFTR podrían ser resistentes a la fiebre tifoidea. No obstante, ningún estudio in vivo ha confirmado esta hipótesis. 

Otro ejemplo más destacado lo hallamos en un estudio de 1994 que ha comprobado la resistencia experimental a la toxina colérica en un modelo en ratones con esta enfermedad. El efecto del número de alelos de la Fibrosis Quística en la secreción intestinal inducida por la toxina colérica ha sido examinada en un modelo en ratones y se ha observado que los ratones que sufrían FQ y no expresaban la proteína CFTR no secretaban fluido en respuesta a la toxina colérica, mientras que los heterocigotos expresaban el 50% de la cantidad normal de proteína CFTR en el epitelio intestinal y secretaban el 50% del fluido normal e iones cloro. Este estudio apoya la hipótesis de la ventaja selectiva de los heterocigotos para esta mutación en la resistencia al cólera y otras enfermedades de deshidratación intestinal como la tuberculosis o la ya citada fiebre tifoidea.

En resumen, según esta hipótesis, el déficit de transmisión de las mutaciones a causa de la muerte de los homocigotos enfermos quedaría contrarrestado por una mayor fecundidad de los portadores sanos heterocigotos, lo cual podría deberse a una incrementada resistencia en estos individuos frente a las toxinas bacterianas causantes de diarreas por hipersecreciones cloradas, lo que resultaría en una menor mortalidad en los niños heterocigotos que en los niños normales por la exposición a estas toxinas. Pero esta teoría popular también ha sido muy cuestionada. Hogenauer et al. encontraron, con un estudio en humanos, que el estado de heterocigoto era indistinguible del estado noncarrier.

Enlaces de interés a esta teoría de la ventaja selectiva:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7524148?dopt=Abstract Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11055897?dopt=Abstract Active intestinal chloride secretion in human carriers of cystic fibrosis mutations: an evaluation of the hypothesis that heterozygotes have subnormal active intestinal chloride secretion.

Diagnóstico (Sara Cordero y Miguel López)

Antes de 1950, la FQ era una entidad conocida pero no bien catalogada, que se englobó en determinados momentos como uno más de los diferentes síndromes malabsortivos o, incluso, como un déficit primario de vitamina A. Probablemente, la inexistencia de pruebas diagnósticas fiables dificultó la comprensión de la enfermedad. El desarrollo del test del sudor en 1959 significó el principal avance en el diagnóstico y, a pesar de los cuarenta años transcurridos, esta prueba sigue constituyendo el pilar fundamental.

TEST DEL SUDOR O PRUEBA DE ELECTROLITOS EN EL SUDOR:

 Con esta prueba se mide la concentración de cloruro sódico en el sudor, tras estimular la glándula sudorípara por iontoforesis con pilocarpina. Se considera positivo si se encuentra una concentración de cloro superior a 60 mmol/l en dos muestras separadas. En los niños, una concentración superior a 40 mmol/l es muy sugestiva de FQ. 

Ha de tenerse en cuenta que la concentración de iones aumenta discretamente con la edad, y que algunos sujetos sanos pueden tener valores superiores a 60 mmol/l. 

En caso de duda se puede realizar la determinación de la concentración de sodio y determinar el cociente Cl/Na, que es mayor de 1 en los pacientes con FQ, estando ambos iones proporcionalmente elevados. 

El test puede tener falsos positivos en el hipotiroidismo, la insuficiencia suprarrenal, la malnutrición grave o la anorexia nerviosa, entre otras. 

En aquellos casos en los que el test del sudor no es concluyente, se ha demostrado como una herramienta muy útil la constatación de la alteración del transporte activo de iones (sodio y cloro) que se produce en el epitelio respiratorio, a través de la medida del diferencial del potencial transnasal (PDN):

El epitelio ciliado respiratorio (incluido el epitelio nasal) regula la composición de fluidos de la superficie de las vías respiratorias mediante el transporte activo de iones sodio y cloro. Este transporte iónico genera una diferencia de potencial transepitelial que puede medirse in vivo, se expresa en milivoltios (mV), depende de la concentración de los diferentes iones y es negativa respecto a la submucosa. La submucosa de todos los epitelios respiratorios es isoeléctrica, al igual que el tejido celular subcutáneo. Por eso es posible tomar como valor de referencia (para establecer una diferencia de potencial transepitelial) cualquier tejido subcutáneo en zonas del cuerpo humano de fácil acceso.
Otro método de diagnóstico de cierta utilidad es la llamada prueba del tripsinógeno inmunorreactivo, que consiste en la extracción de una muestra de sangre que posteriormente es examinada en busca de un aumento en los niveles de tripsinógeno inmunorreactivo, una proteína producida por el páncreas que está relacionada con la fibrosis quística.

Por otra parte, desde 1975 se han descrito pacientes con alta sospecha diagnóstica de FQ, pero con un test del sudor negativo. Estos casos han ido proliferando paralelamente al mayor conocimiento del gen de la CFTR y de los efectos que sus mutaciones tienen sobre el individuo.

El único método directo existente para el diagnóstico de la enfermedad es el hallazgo de mutaciones en los dos alelos del gen de la CFTR. Hasta la fecha se han descrito más de 1824 mutaciones, lo que dificulta en gran medida el diagnóstico molecular.  

El amplio abanico de mutaciones existentes ha permitido establecer importantes relaciones entre el genotipo del paciente (la combinación de mutaciones que presenta) y los fenotipos (características clínicas de la enfermedad). El fenotipo clásico de la FQ, con insuficiencia pancreática, infertilidad masculina, enfermedad pulmonar progresiva y concentración elevada de iones en el sudor, se asocia a la presencia de mutaciones graves (siendo la  F508 la mutación tipo) en ambos cromosomas. Este tipo de enfermo es el que suele diagnosticarse en la etapa infantil. El problema diagnóstico puede surgir cuando se encuentra un paciente con, al menos, una mutación leve. En estos casos, el espectro clínico de la enfermedad puede variar ampliamente, con ausencia de clínica digestiva, fertilidad e, incluso, un test del sudor normal, con el consiguiente problema diagnóstico que conlleva.

Para aumentar la eficacia y precisión en el diagnóstico de esta enfermedad, se han desarrollado una serie de pruebas que podrían englobarse con el nombre de diagnóstico molecular. Este diagnóstico puede ser directo o indirecto.

- Diagnóstico molecular indirecto: basado en el análisis del ligamiento, es decir, de la segregación conjunta de la enfermedad y secuencias polimórficas ligadas al locus de la misma. Existen varios métodos:

• RFLP (Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción): es una técnica actualmente en desuso. Los RFLP son marcadores génicos del ADN que se pueden encontrar en exones, intrones o en el ADN que separa un gen del otro. La técnica RFLP se usa como marcador para identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas enfermedades genéticas. Se analizaba el ADN de los miembros de una familia afectada por la enfermedad, y se buscaban los alelos para RFLP que mostraban patrones de herencia similares a los de la enfermedad. Una vez el gen era localizado, el análisis RFLP de otras familias podría predecir su riesgo de padecer esa enfermedad, o quiénes tenían posibilidades de portar el gen mutante.
• Marcadores microsatélites: es el método utilizado en la actualidad, con el inconveniente  de que los estudios solo son válidos dentro del mismo árbol familiar. Los microsatélites son secuencias de ADN en las que un fragmento se repite de manera consecutiva. La variación en el número de repeticiones crea diferentes alelos. Los microsatélites del gen CFTR se ubican en las regiones intrónicas.  La estandarización y el análisis de estos microsatélites en una población de individuos afectados puede resultar muy útil para el estudio de las mutaciones causantes de la enfermedad.
• Marcadores SNP: los estudios del polimorfismo de un único nucleótido serán los más empleados en un futuro próximo, debido a la ventaja de que los resultados obtenidos son aplicables entre personas no emparentadas.

- Diagnóstico molecular directo: basado en la detección de las mutaciones, que se realiza básicamente a partir de dos estrategias:

• Rastreo de mutaciones: mediante estas técnicas, se detecta si hay mutación, pero no es posible identificarla. La técnica más empleada es la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacion (DGGE), que consiste en la separación de cadenas de ADN de doble cadena dependiendo de su punto de desnaturalización. Es una técnica que permite discernir diferencias o composiciones discretas entre muestras de moléculas de complejidad variable, y que de otras formas analíticas, serían muy costosas de diferenciar. Así, permiten detectar si existe alguna mutación en el genoma, pero no identificar exactamente de que mutación se trata. Al ser posible discriminar dos cadenas dobles de ADN con el mismo tamaño pero con diferencias en secuencia si la energía necesaria para llegar a su desnaturalización es diferente, DGGE permite definir aproximadamente la cantidad de fragmentos de ADN del mismo tamaño que tienen secuencias con diferente contenido de GC.
• Identificación de mutaciones, que son técnicas basadas en hibridación específica con el alelo mutado. Cabe destacar dos técnicas:

       - ASO dot blot :Este método consiste en amplificar el ADN de interés y fijarlo directamente a la membrana de trabajo (por ejemplo con irradiación UV), para luego añadir oligonucleótidos de unas 20 pb específicos del alelo que quiere detectarse. Estos oligos son marcados previamente con radiactividad, fluoróforos o cualquier otro tipo de marcaje. Tras la hibridación, se obtienen los resultados detectando el marcaje utilizado.

    Para la detección de mutaciones se fija una fila de muestras, cada una correspondiente a un individuo diferente, del cual se ha amplificado la región de ADN que puede o no contener la mutación. Primeramente se hibridan las muestras con un oligo específico de uno de los alelos (el silvestre o normal, por ejemplo) y se revela el resultado. A continuación, se lava la sonda y se añade una nueva, específica del otro alelo (el alelo mutado, por ejemplo). Aquellos individuos que dieran positivo para las dos hibridaciones serían heterocigotos para la mutación (poseen un alelo normal y el otro mutado), mientras que aquellos que solamente presentasen hibridación en uno de los casos serían homocigotos para ese caso (para el alelo silvestre o el mutado).

          - OLA: también llamado ensayo de ligación de oligonucleótidos, es una técnica de diagnóstico que automatiza la técnica dot blot. Se empieza con una PCR para amplificar los fragmentos de ADN del gen de estudio. A continuación se realizan ciclos de ligamiento con ligasa termoestable y oligos específicos de los alelos. Luego se estudian los fragmentos por medio de una electroforesis capilar.El juego con las longitudes y los colores de los fluorocromos nos permite distinguir las distintas mutaciones y los distintos alelos de cada uno.



Finalmente, cabe mencionar que el screening neonatal de la FQ, aunque conocido desde 1971, sólo se realizaba en 1997 en tres estados de los EE.UU. y en Autralia. 
Consiste en determinar en sangre periférica (3 a 5 días después del nacimiento) la tripsina inmunorreactiva y, si ésta se encuentra elevada, efectuar un estudio genético para la mutación  F508. Si dicha mutación está en homocigosis, el recién nacido padece una FQ. Si sólo se detecta una mutación podría tratarse de un portador. Este protocolo tiene una sensibilidad de un 95%, buena especificidad y un valor predictivo positivo del 15-35%33. Algunos autores defienden esta estrategia dado que la evolución de los pacientes diagnosticados por screening es mejor desde el punto de vista nutricional, aunque apenas se modifica en lo referente a la función pulmonar. Otros autores la rebaten, pues se ha comprobado que los pacientes diagnosticados por screening neonatal se colonizan más precozmente por P. aeruginosa, probablemente debido a las frecuentes visitas hospitalarias. 

Tratamiento e investigación (Javier Adarraga y Irene Martínez)

Tratamiento

El tratamiento de la fibrosis quística va dirigido a luchar contra las complicaciones de la enfermedad y a mejorar la calidad de vida del paciente, porque no se dispone de un tratamiento curativo a día de hoy. El tratamiento se asienta sobre tres pilares básicos: antibioterapia, fisioterapia y nutrición, a los que se deben sumar, según los casos, una adecuada asistencia respiratoria con oxigenoterapia y probablemente ventilación asistida.

a. Antibióticos para tratar la enfermedad pulmonar (antibioterapia)

La finalidad del tratamiento de los problemas respiratorios es volver las secreciones más fluidas, para evitar la obstrucción bronquial, y prevenir y tratar las infecciones

Siempre que sea posible, los antibióticos deberían ser elegidos en función de los microorganismos detectados en el esputo y de su sensibilidad. La vía de administración varía según la gravedad de la infección. Puede ser oral o intravenoso.

b. Otros métodos para tratar la enfermedad pulmonar ( fisioterapia y nutrición)

La fisioterapia respiratoria consiste básicamente en la limpieza bronquial diaria, con el fin de evitar la acumulación de mucosidad en los bronquios y prevenir la infección. Existen diferentes técnicas de fisioterapia respiratoria que consiste en realizar una serie de respiraciones acompañadas de tos colocándose el paciente en diferentes posturas con el fin de eliminar las secreciones.

Nutrición: Los pacientes con FQ tienen mayor riesgo de malnutrición como consecuencia de la maldigestión y malabsorción secundaria a la deficiente producción de enzimas pancreáticas así como alteraciones hepáticas y de la propia pared intestinal). Los déficit energéticos también resultan del incremento en el consumo de oxígeno y del gasto energético en reposo y contribuyen a empeorar la enfermedad pulmonar haciendo más difícil la recuperación de las exacerbaciones. El propósito de la suplementación nutritiva durante la exacerbación pulmonar es la provisión de las calorías adecuadas para ayudar a mantener la inmunocompetencia, promover el crecimiento y desarrollo óptimo y prevenir las deficiencias específicas (hipomagnesemia, o déficit de vitamina A o E).

Broncodilatadores

Los broncodilatadores son frecuentemente usados para vencer la obstrucción de la vía aérea ya que disminuyen la hiperrespuesta bronquial y estimulan el aclaramiento mucociliar.

d. Trasplante, moduladores de la proteína CFTR y terapia génica

Transplante de pulmón:

El trasplante pulmonar es la única alternativa terapéutica en los pacientes con fibrosis quística (FQ) en estadio avanzado y creciente intolerancia al ejercicio (fatiga o agotamiento muscular desproporcionados para el ejercicio realizado). Aunque el trasplante de un único pulmón es viable en otras enfermedades, en los pacientes con FQ ambos deben ser reemplazados ya que, de otro modo, las bacterias alojadas en el órgano remanente podrían infectar a aquél que ha sido trasplantado.

Indicaciones de trasplante pulmonar en España (datos de la Organización Nacional de Trasplantes, 2003).EPOC: enfermedad pulmonar obstructiva crónica; FPI: fibrosis pulmonar idiopática; FQ-BQ:fibrosis quística-bronquiectasias; HTP: hipertensión pulmonar; RT: retrasplante

Terapia Génica

En las primeras terapia génicas los científicos se basaron en la utilización de algunos virus, como oncoretrovirus (virus cancerígenos de ratones) o adenovirus (virus del resfrío común) pero fueron descartados debido a la ineficacia de la transferencia del CFTR a las células pulmonares y porque la continua expresión génica de los virus, que seguían elaborando proteínas de virus, ocasiona inflamación. Para solucionar estos problemas, se diseñaron nuevos adenovirus vacíos, carentes de genes virales, los cuales producen muy poca inflamación de las células pulmonares y la expresión a largo plazo del CFTR ha resultado en modelos de ratones.

Uno de los pocos virus que no parece ocasionar patología es el virus adeno asociado, o AAV. Se trata de un virus muy pequeño que usualmente requiere de adenovirus para multiplicarse y tiene la interesante propiedad de integrar su ADN al genoma humano en una región específica del cromosoma 19. Este hecho es muy valioso, ya que si sabemos, por ejemplo, a dónde va un gen CFTR, podemos estar razonablemente seguros de que está alejado de los genes que ocasionan cáncer si son perturbados. Por desgracia, este pierde su capacidad de integrarse cuando está portando un gen humano en su ADN. Cuando se utilizó AAV en estudios clínicos con unas 200 personas con fibrosis quística, éste sí transfirió el gen de manera inocua, sin embargo desafortunadamente la expresión no duró mucho y parece que la repetición de dosis no funciona porque los pacientes desarrollaron inmunidad ante las proteínas que recubren el virus. A pesar de esto,algunos de los vectores AAV más nuevos que tienen diferentes recubrimientos (“serotipos”) parecen otorgar una transferencia más eficiente del gen a las células pulmonares.

Actualmente se utilizan que utiliza vectores virales o liposomales, y terapia con células madre. Se requiere establecer una secuencia de ADN con un gen CFTR sano con todas sus señales de control que podría corregir el defecto causante de la FQ. A este gen CFTR sano se lo disimulaba entre un material graso conocido como liposoma para ayudarlo a pasar inadvertido en el sistema inmunológico de los pacientes y que se fusionen con la membrana de las células del epitelio pulmonar y el ADN entra en las células donde puede producir la versión correcta de la proteína afectada y revertir los síntomas respiratorios de la fibrosis quística.

Podrán ser inhalados en forma de gotitas de aerosol, en sesiones que se prolongarán durante cuatro horas para que cuando el liposoma choque contra una célula pulmonar, se disuelva en su membrana y arrastre en su carga el diminuto trocito de ADN dentro de la célula.

Otro tratamiento con nuevas técnicas permiten a los científicos “cambiar” las células madre en células mucho más primitivas que se asemejan a las células de los embriones denominadas células madre producidas pluripotenciales o iPS.

Tratamiento según el tipo de mutación

Dentro del desarrollo de los fármacos reparadores de la proteína CFTR, se han identificado 3 grupos principales:

- Mutación de clase I, los supresores del codón de parada prematuro. EL 10% de los casos de FQ sufren esta mutación. Estos fármacos consiguen que no se identifique este codón de parada prematuro, por lo que la proteína puede seguir su síntesis al completo.Esto lo consigue mediante la inserción de un aminoácido que permite a los ribosomas continuar la lectura del gen produciendo una proteína de longitud completa.

- Mutación de clase II los denominados fármacos correctores del CFTR.Las mutaciones de clase ii están presentes en un elevado número de los pacientes con FQ, puesto que incluyen la mutación más frecuente de la enfermedad (Phe508del).  Estos fármacos están diseñados para corregir el tráfico de la proteína con defectos en el plegamiento hasta la membrana celular donde podría hacer su función casi con normalidad. Se ha planteado la combinación de dos fármacos el lumacaftor que ayuda  al movimiento de Phe508del CFTR a la superficie de la célula e ivacaftor aumenta el tiempo de apertura y la conducción de cloro a través de la célula epitelial. Esta combinación de medicamentos está en Fase II.

- Mutación de clase III IV V y VI los denominados potenciadores del CFTR. Estos fármacos tienen por diana la proteína CFTR que está en la superficie celular, con objeto de mejorar su función.

Enlaces de interés:

http://www.archbronconeumol.org/es/diagnostico-tratamiento-exacerbacion-infecciosa-fibrosis/articulo/12782/

http://www.fibrosisquistica.org/index.php?pagina=vivir&vivir=tratamiento

http://www.cfww.org/pub/spanish/cfwnl/10/317/Nuevos_avances_en_terapias_g%C3%A9nicas_y_celulares_para_la_fibrosis_qu%C3%ADstica

http://www.archbronconeumol.org/es/tratamientos-reparadores-proteina-cftr-fibrosis/articulo/90290902/